從國內(nèi)標準了解單增李斯特菌新型檢測方法
發(fā)布時間：2024-09-04 瀏覽次數(shù)：812
單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌，感染會造成敗血癥、腦膜炎、胃腸炎等李斯特菌病，嚴重還會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)甚至造成孕婦流產(chǎn)，被世界衛(wèi)生組織定為四大食源性細菌之一，所以關(guān)于單增李斯特菌的檢測與控制顯得尤為重要。傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測方法(國標GB4789.30-2016 )包括增菌、分離、鑒定三部分(圖一)，整個定性過程大約需要1周時間。隨著科學技術(shù)的發(fā)展與實際需求，越來越多靈敏、快速的單增李斯特菌檢測方法被發(fā)現(xiàn)，不斷有新技術(shù)被納入國家標準/行業(yè)標準，例如：環(huán)介導恒溫核酸擴增、微滴式數(shù)字PCR、實時熒光PCR、酶聯(lián)免疫法、免疫磁珠法以及PCR-試紙條法。
圖一：GB4789.30-2016
一、環(huán)介導恒溫核酸擴增(SN/T5367.1—2022)
用環(huán)介導恒溫核酸擴增(LAMP)技術(shù)進行單核細胞增生李斯特氏菌的篩選檢測是根據(jù)單核細胞增生李斯特氏菌屬特有靶序列上的6個獨立區(qū)域，采用6條特異引物通過穩(wěn)定的Bst DNA 聚合酶來驅(qū)動擴增反應，在60 ℃左右完成恒溫擴增。在環(huán)介導恒溫核酸擴增反應中,焦磷酸鹽(PPi)通過ATP-硫酸化酶被轉(zhuǎn)化成三磷酸腺苷(ATP)。熒光素酶利用ATP發(fā)光，從而實現(xiàn)實時檢測。
圖二：SN/T5367.1—2022
二、微滴式數(shù)字PCR(SN/T5364.6—2021)
微滴式數(shù)字PCR是針對單核細胞增生李斯特氏菌溶血素(hly)基因片段設計引物、探針，將一定濃度的引物、探針與模板DNA 及數(shù)字PCR 反應預混液混合，配成PCR 反應體系。將該數(shù)字PCR 體系分布到10 000~20 000個微滴中，使大部分微滴中模板DNA 分子的數(shù)量為1或0，然后進行PCR擴增。hly 基因探針5’端標記FAM 熒光基團，利用數(shù)字PCR 系統(tǒng)的檢測通道，可對每個微滴的熒光信號進行采集分析。含有模板DNA 的微滴出現(xiàn)熒光信號的增強，形成陽性微滴簇。根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含有單核細胞增生李斯特氏菌。
圖三：SN/T5364.6—2021
三、酶聯(lián)免疫法(GB/T22429-2008)
將做增菌處理后的增菌液經(jīng)加熱處理后移入包被特異性抗體(一抗)的固定容器中內(nèi)，使目標菌與一抗結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他成分后加入特異性酶標抗體(二抗)，再次洗去未結(jié)合的其他成分，加入特定底物與之反應后可以生成熒光化合物或有色化合物，通過檢測熒光強度或吸光度，與參照值比較即可得到檢驗結(jié)果。
圖四：GB/T22429-2008
四、免疫磁珠法(SN/T0184.3-2008)
免疫磁珠法是將直徑0.05um～4um具有磁性的微珠的表面化學修飾，并與李斯特氏菌特異性抗體結(jié)合，制成免疫磁珠，它能與食品中李斯特氏菌抗原結(jié)合，從而檢出食品中的李斯特氏菌。樣品經(jīng)24～48h增菌后，分別取1mL增菌液和20ul免疫磁珠加入帶蓋塑料管中，在磁板背景下混合，如果有李斯特氏菌抗原存在，免疫磁珠就會將其捕獲，然后利用磁性將免疫磁珠聚集，經(jīng)清洗后接種到顯色培養(yǎng)基和任選一種培養(yǎng)基(OXA 或PALCAM瓊脂)，對于選擇性分離平板上典型李斯特氏菌菌落進行確認，最終通過系列試驗確定是否存在單核細胞增生李斯特氏菌。
圖五：SN/T0184.3-2008
五、PCR-試紙條法(SN/T5439.7—2022)
對樣品中單核細胞增生李斯特氏菌進行增菌培養(yǎng)后提取DNA，采用上游和下游引物分別經(jīng)地高辛和異硫氰酸鹽標記的單核細胞增生李斯特氏菌的特異性檢測引物進行PCR擴增。檢測用試紙條上含有金標記的抗異硫氰酸鹽的抗體，可與PCR產(chǎn)物上的異硫氰酸鹽標記分子結(jié)合，在檢測線位置上有抗地高辛抗體，可與PCR產(chǎn)物上的地高辛標記分子結(jié)合，從而顯色。如模板未擴增，則無PCR 產(chǎn)物與地高辛抗體及FITC抗體結(jié)合，從而不能在檢測線(T線)位置顯示顏色。
圖六：SN/T5439.7—2022
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~李穎
